細(xì)胞凍存和復(fù)蘇是細(xì)胞培養(yǎng)中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，直接影響細(xì)胞存活率和活力，關(guān)系到后續(xù)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)?zāi)芊癜凑沼?jì)劃有效地進(jìn)行。要想做好細(xì)胞凍存和復(fù)蘇，首先請(qǐng)牢記下面這四個(gè)字：
 

　　慢凍快融！
 

　　1、為什么要慢凍快融？
 

　　凍存細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境中的水會(huì)形成冰晶。如果直接將細(xì)胞凍存到 -196℃ 的液氮中，由于凍結(jié)過程中胞外溶液中的水先結(jié)冰，使胞外溶液不斷濃縮，引起細(xì)胞電解質(zhì)升高、滲透壓改變、脫水及蛋白質(zhì)變性等，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞受到機(jī)械性損傷。
 

　　2、細(xì)胞凍存-讓你細(xì)胞安心沉睡
 

　　3、細(xì)胞復(fù)蘇-讓細(xì)胞滿血復(fù)活
 

　　■ 細(xì)胞拿取
 

　　盡量減少樣品從液氮或 -80℃ 取出到放置在解凍裝置中之間被動(dòng)升溫的時(shí)間，否則會(huì)大大影響細(xì)胞活力。如果儲(chǔ)存裝置和解凍裝置相隔較遠(yuǎn)，可使用裝有干冰 (-80°C) 或液氮 (-196°C) 的隔熱容器臨時(shí)保存和運(yùn)送細(xì)胞。
 

　　復(fù)蘇后第二天發(fā)現(xiàn)細(xì)胞沒有活？好不容易復(fù)蘇的細(xì)胞竟然污染了？怎么才能讓細(xì)胞滿血復(fù)活呢？繼續(xù)和小 M 一起往下看吧！■ 細(xì)胞拿取
 

　　盡量減少樣品從液氮或 -80℃ 取出到放置在解凍裝置中之間被動(dòng)升溫的時(shí)間，否則會(huì)大大影響細(xì)胞活力。如果儲(chǔ)存裝置和解凍裝置相隔較遠(yuǎn)，可使用裝有干冰 (-80°C) 或液氮 (-196°C) 的隔熱容器臨時(shí)保存和運(yùn)送細(xì)胞。(注意：從液氮中取細(xì)胞時(shí)要佩戴護(hù)目鏡和手套，謹(jǐn)防凍傷及凍存管爆炸！)
 

　　■ 解凍方式a) 解凍細(xì)胞時(shí)需要快速升溫 (50~100℃/min) 才能最大保存細(xì)胞活力，解凍方式是 37℃ 水浴[3]。從液氮或 -80℃ 取出凍存的細(xì)胞后，稍擰松管蓋，防止解凍過程中凍存管炸裂。放入 37℃ 水浴中，持續(xù)搖晃 1-2 分鐘直至解凍。
 

　　通常建議在可見冰融化但樣品仍然冰冷(~0℃)時(shí)立即停止解凍，常見的做法是在只剩下一小片冰時(shí)從水浴鍋中取出樣品。升溫至室溫或更高溫度會(huì)增加冷凍保護(hù)劑的細(xì)胞毒性，這會(huì)極大影響細(xì)胞活力[1]。
 

　　b) 不建議室溫解凍細(xì)胞，因?yàn)檫@會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡。
 

　　c) 為降低污染風(fēng)險(xiǎn)，水浴解凍時(shí)凍存管管口要高于水面，避免水流入凍存管，水浴鍋中的無(wú)菌水也要定期更換。
 

　　■ 稀釋
 

　　解凍后應(yīng)盡快稀釋，以減少 DMSO 的細(xì)胞毒性。按照培養(yǎng)基：凍存液 ≥10:1 的比例加入培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋，然后離心并更換培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，這樣可以減少由滲透壓變化導(dǎo)致的細(xì)胞應(yīng)激。
 

　　■ 換液
 

　　依據(jù)細(xì)胞狀態(tài)，在細(xì)胞貼壁后或 24 h 后換液，繼續(xù)培養(yǎng)。