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瓊脂糖凝膠與核酸電泳小知識分享

更新時間:2023-03-20      點擊次數(shù):1723
  影響核酸電泳遷移率的幾個因素
 
  1、核酸分子大小
 
  在一定濃度的瓊脂糖凝膠中,DNA片段遷移距離和其含有的堿基對數(shù)量成反比,因此可以通過與標(biāo)準(zhǔn)條帶遷移距離進行比較,由此得出目的條帶的大小,但這僅對雙鏈線性的DNA比較準(zhǔn)確(DNA Marker一般為雙鏈線狀DNA),且對大于20kb的DNA不適用(普通瓊脂糖凝膠很難將其分開)。
 
  2、核酸分子構(gòu)象
 
  DNA分子在電場中的遷移速度不僅和分子量有關(guān),還和它本身的構(gòu)象有關(guān)。相同分子量的線狀、開環(huán)和超螺旋DNA在瓊脂糖凝膠中的移動速度不一樣,移動速度次序為:共價閉環(huán)DNA>線性DNA>開環(huán)DNA。當(dāng)瓊脂糖濃度太大時,環(huán)狀的DNA一般不能進入膠內(nèi)(停留在孔中)。
 
  3、瓊脂糖濃度
 
  同樣的線狀DNA分子在不同濃度的瓊脂糖凝膠中的遷移速度不同,DNA電泳遷移率的對數(shù)和瓊脂糖凝膠濃度呈線性關(guān)系,凝膠濃度的選擇取決于DNA分子的大小。
 
  瓊脂糖凝膠濃度與線性DNA分辨范圍
 
  凝膠濃度(%)           線性DNA長度(bp)
 
  0.5                           1000~30000
 
  0.7                           800~12000
 
  1.0                           500~10000
 
  1.2                           400~7000
 
  1.5                           200~3000
 
  2.0                           50~2000
 
  4、電源電壓
 
  在低電壓時,線狀DNA片段的遷移速率和所加電壓成正比。但電壓增加,瓊脂糖凝膠的有效分離范圍將縮小。要使大于2kb的DNA片段的分離率達到最大,所使用的電壓不得超過5V/cm。
 
  5、電泳方式
 
  用于分離核酸的瓊脂糖凝膠電泳可分為垂直型及水平型(平板型)。垂直型電泳,一般用聚丙烯酰胺凝膠做為支撐物。水平型電泳時,凝膠板完全浸泡在電極緩沖液下1-2mm,故又稱為潛水式。目前更多用的是后者,因為它制膠和加樣比較方便,電泳槽簡單,易于制作,又可以根需要制備不同規(guī)格的凝膠板,節(jié)約凝膠,因而較受歡迎。
 
  6、嵌入染料的存在
 
  常用的熒光染料EB可以嵌入到堆積的堿基對之間,使其剛性更強,并使其遷移速率有所下降。
 
  7、電泳緩沖液的離子強度
 
  電泳緩沖液的組成和離子強度也能影響DNA的遷移速度。在離子存在很少的情況下(如無用蒸餾水配制凝膠),電導(dǎo)率最小,DNA幾乎不移動;在高離子強度的緩沖液中(如誤用10×電泳緩沖液),則電導(dǎo)率很高并產(chǎn)熱明顯,嚴(yán)重時能引起凝膠融化或DNA變性。
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